关于PIPE恢复听力毛细胞的介绍

发现PIPE，一种治疗与耳蜗突触相关的感音神经性听力损失的小分子治疗剂

*丹尼尔·罗兰、迈克尔·潘、卡琳·斯特宾斯、杰拉尔丁·卡夫雷拉、亚历克斯·布罗德海德、乔恩·塞德斯和杰夫·罗普管道疗法，加利福尼亚州圣地亚哥

.01

PIPE是一种正在开发的γ分泌酶抑制剂，用于治疗与耳蜗突触融合相关的SNHL。听觉丧失动物模型的一系列体外和体内研究已经证明了导致听觉功能恢复的两种不同的作用机制。具体来说，PIPE1)通过Netrin/DCC途径促进SGN神经突生长，导致内部毛细胞带状突触再生，2)通过减少导致外部毛发形成的Notch信号增加Atoh1表达。这些细胞再生效应一起，恢复听觉功能。

PIPE引起剂量依赖性ⅰ型螺旋神经节神经突起生长

管道(微米)

神经突生长出刚果民主共和国

[NXT1](M)

神经突起长度

车辆NT30....1

0.

0.

0.

0.

0.

介绍

PIPE恢复听觉神经突触和毛细胞

轴突长度

车辆1米新界

AZD

10pMBMS10pMBMS1nMBMS10nMBMS10nMBMS1MBMS

0.

0.

0.

0.

0.

0.

BACEi

凹口保留

轴突长度

总之，管道恢复内部毛细胞的SGN连接并再生外部毛细胞。这些效应分别通过两种不同的γ分泌酶底物DCC和Notch介导。一项首次人体研究计划评估伴有耳蜗突触融合的SNHL患者的PIPE。听觉和语言清晰度的测量将被评估。

管道通过凹槽抑制增加毛细胞

PIPE改善了听觉测量FrEquEny(kHz)THrEsHoLD(dB)CorEPIPE-，2%***********

二甲基亚砜

pipepIPe-?mhes5(normtorpl19)vehICle.03..00.00.00.01.01.01.1140455pipe-?mmyo7a+ohcs每mABR波1PIPE恢复ABR波1振幅，ABR阈值PIPE提高ABR阈值，OHC功能测量Hes5折叠增加/车辆PF20.2%2%0.00.51.0#Ohc/区域未处理车辆0.02%0.2%2%PIPE-******；Atoh1Atoh1(折叠增加/车辆)车辆0.2%2%***

离体外植体体内药物治疗

等级

heS5↓Atoh1

PIPE↓γ分泌酶↓Hes5↓OhcOhcdBSPLABRWAveI10。.80.0.00.51.01.5伏高压仪表板E-，2%不适用

通过有效的选择性拮抗剂对毒蕈碱性M1乙酰胆碱受体的小分子抑制促进了OPC的分化

*潘国梁、金莎·洛雷恩、阿丽亚娜·洛伦扎娜、卡琳·斯特宾斯、亚历山大·布罗德海德、托马斯·施拉德、熊宜丰、吉尔·巴切伊、阿里·格林、乔纳·陈、丹尼尔·洛雷恩；Biol。，化学。加利福尼亚州医院；神经。加利福尼亚州三藩市UCSF

介绍

由非选择性毒蕈碱拮抗剂(例如克司他丁、苯妥英)对毒蕈碱乙酰胆碱能受体的抑制加速了少突胶质细胞前体细胞向少突胶质细胞的分化。随后的工作表明M1亚型是这种现象的关键驱动力。内部化学努力已经确定了许多有效的、选择性的M1拮抗剂。利用这些，我们已经在一系列不同的体外试验中描述了抑制M1效应的特征，包括OPC分化、皮质髓鞘形成和器官型脑切片。我们的数据显示，M1的一种选择性小分子抑制剂足以驱动OPCs向分化，并且所产生的少突胶质细胞表达髓鞘碱性蛋白。此外，这些OLs是功能性的，即能够轴突包裹和诱导Ranvier节点。值得注意的是，一种M3选择性拮抗剂(Sagara等人，2年)在大鼠OL分化试验中没有活性。与我们的体内数据(也在本次会议上介绍)一致，可以提出一个强有力的案例，即M1选择性小分子拮抗剂的开发是治疗脱髓鞘疾病(如多发性硬化症)的一种有希望的方法。

[H]NMS膜结合

对M1的双重选择性

复合M1航空公司M2/M1M3/M1M4/M1M5/M1

苯妥英1....7

管道....4

管道..

化合物...95.37

化合物..

化合物.....5

化合物.34148538

化合物..41..07

化合物..

管道..

化合物.5038..1n.d.

表1管道化合物在mAChR重组膜结合试验中对人M1病毒是有效和选择性的。

*来自Banyu的小分子M3选择性拮抗剂(Sagara等人，2年)。Ki(nM)代表M1:，M2:，M3:25.5，M4:in3HNMS膜结合

人脑切片

邓尼特的倍数

比较测试重要吗？汇总调整后的P值车辆与MT7是0.车辆与管道否0.

车辆对化合物77是0.车辆MT7OPCOPC7975MBPM1折叠变对车辆(2-DDCT)纳米1米1米

图4管道M1拮抗剂在一个幼稚的人皮质脑切片分析中诱导Mbp。在核糖核酸分离和定量聚合酶链反应之前，切片在MT7或化合物中孵育9天。

结论

选择性抑制M1导致OPCs分化为成熟少突胶质细胞。在这里，我们描述了通过[H]NMS结合和钙动员试验评估的有效的、选择性的小分子M1拮抗剂的鉴定，并进一步表明这些分子诱导有髓鞘形成能力的少突胶质细胞。这些分子也在小鼠和人类器官型切片模型中诱导Mbp。综上所述，这提供了令人信服的证据，表明管道公司开发的小分子拮抗剂抑制M1对治疗脱髓鞘疾病如多发性硬化症有积极的影响。在这一点上，已经确定了一个临床开发候选人，并且已经启动了IND使能研究。

一种新的4-氨基甲基哌啶类M3毒蕈碱受体拮抗剂的鉴定及其M3选择性的结构观察。《医学化学》，2年；49(19)，。

用于高通量筛选的中枢神经系统轴突髓鞘形成试验的发展。BMCNeuro，年；17(6)。

炎症性脱髓鞘过程中的加速髓鞘再形成可防止轴突丧失并促进功能恢复。eLife，年；5:e。

参考

1米

Cmpd77

1米

PIPE

*卡琳

PIPE，一种新型、有效和选择性的M1毒蕈碱受体拮抗剂，作为多发性硬化中髓鞘再形成的治疗方法

斯特宾斯、潘宗光、布罗德海德、Edu、洛伦萨纳、洛伦萨纳、金莎、施拉德、熊宜丰、吉尔·巴切伊、克里斯多夫·巴切伊、阿里·格林、

乔纳·陈和丹尼尔·罗兰。加利福尼亚州医院；UCSF，加州旧金山神经内科

PIPE以高亲和力与M1结合，并显示出对其他毒蕈碱受体的选择性

PIPE在体外促进OPC分化，在体外增加髓鞘再形成

介绍

效力(nM)

膜结合，Ki0.

钙通量，IC.69

折叠选择性

M2/M1·M3/M1·M4/M1·M5/M1

膜结合，Ki130

钙流量，IC524326315

25

0

25

50

75

测井[管道]，M

车辆占总收入的百分比:。nM

旨在刺激髓鞘再形成的新的小分子方法将极大地补充免疫疗法，并在诸如多发性硬化症等脱髓鞘疾病中提供显著的神经保护。最近，我们将毒蕈碱M1受体(M1R)描述为少突胶质前体细胞分化的重要调节因子和药物发现的有前途的靶点。我们开发了PIPE，一种新型的、有效的和选择性的M1R拮抗剂，并强调了其对髓鞘再形成的潜在作用。

车辆T3牛米管道

10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

[PIPE-](logM)Mbp感应(车辆上方)EC.nM原始LPC车辆LPCMT7PIPE-20MBP地区/Hoechst计数nM1mM车辆LPCMT7PIPE-....卡斯珀计数/图加里亚纳米1毫米MBP卡斯珀赫希斯特

PIPE体外剂量依赖性分化大鼠OPCs为少突胶质细胞

PIPE在培养的小鼠皮层切片中剂量依赖性诱导Mbp

PIPE增加小鼠皮质切片中的MBP和胱天蛋白酶蛋白

MBP·赫希斯特

车辆LPC管道

毒蕈碱M1拮抗剂PIPE通过视觉诱发电位(VEP)和电子显微镜检查(EAE)实验性自身免疫性脑炎小鼠体内的髓鞘再形成

杰拉尔丁·C·edu*、卡琳·J·斯特宾斯、亚历山大·R·布罗德海德、迈克尔·M·潘、阿丽亚娜·O·洛伦萨纳、托马斯·施拉德、熊宜丰、吉尔·巴切伊、阿里·J·格林、乔纳·陈和丹尼尔·S·洛伦。管道疗法，加利福尼亚州圣地亚哥；神经。加利福尼亚州三藩市UCSF

多发性硬化的特征是免疫介导的髓鞘损伤和进行性轴突丧失。视觉诱发电位(VEP)是一种用于多发性硬化症患者的临床可翻译模型，因为它能够通过视觉诱发电位的潜伏期来测量视觉通路的髓鞘损伤，该潜伏期反映了沿着视觉通路的信号传导速度；而VEP振幅被认为与视网膜神经节细胞的轴突损伤密切相关(RGC)。PIPE是一种新型、有效和选择性的M1拮抗剂，具有良好的口服暴露和脑渗透作用，在脱髓鞘的啮齿动物模型中有效，如铜氧虫酮和实验性自身免疫性脑炎(EAE)。记录EAE小鼠的闪光视觉诱发电位，以确定选择性M1拮抗剂是否能显示功能性髓鞘再形成。收集脊髓和视神经进行电子显微镜成像，计算迁移率以确认髓鞘再形成。

介绍

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

。日间临床评分工具

PIPE-对EAEVEP小鼠有效

406080120

0

10

20

30

N1潜伏期(毫秒)n1潘普利图德(?V)车辆PIPEVEP

图1A。方法研究EAE模型中PIPE的时间线，同时进行闪光VEP记录。1B。记录之前，EAE小鼠在一个有红色灯光的房间里黑暗适应1小时。用氯胺酮/赛拉嗪(75/10毫克/千克)麻醉小鼠，用1%托吡卡胺扩张眼睛2分钟。Genteal滴管用于润滑，小鼠放置在Celeris诊断公司的D型(洛厄尔，马萨诸塞州)37F加热平台上。麻醉后10分钟，小心放置电极并进行闪光VEP执行，其中每项检查包括至少3次运行，脉冲强度为3cd.s/m2，频率为1Hz，接通时间为4ms，脉冲颜色:白色K，每次结果扫描次。闪光视觉诱发电位是从每只眼睛独立同时记录的。N1延迟由3条VEP轨迹的平均N1决定。1C.在第11天首次检测到EAE的临床症状，在研究结束时，PIPE显著减轻了EAE的临床残疾。1D。在同样的动物中，闪光VEP检测到N1潜伏期与PIPE的差异，早在MOG诱导后7天，随着时间的推移，这种影响在21天变得更加显著。1E.每个单个眼睛散点图显示N1P2振幅和N1潜伏期测量值是在MOG诱导后21天的显著相关测量值，PIPE(Y=0.*X+2.)具有比车辆(Y=0.*X+1.)显著更正的斜率。

甲乙

CD

E

M1的对手保持了VEP振幅的对称性

PIPE减少了N1延迟偏移和N1P2幅度下降

0.4

0.6

0.8

1.0

轴突直径(μm)运输工具管道

根据开量化的图像(n=独立动物)****P0.1对车辆，不成对t检验

无髓轴突

髓鞘再形成的轴突载体PIPE-%髓鞘再形成的轴突每x电磁图像

??

来自4只独立动物的1张定量图像

**P0.01与车辆、不成对的测试车辆管道

0

10

20

30

40

每倍电镜下无髓轴突百分比

?

来自4只独立动物的1张定量图像

*P0.05与车辆、不成对的未测试车辆管道

0

10

20

%髓鞘再生轴突

*****

幼稚车辆PIPE

0

20

40

60

%无髓轴突平均每只动物定量，每组5-6只动物

p0.01，p0.1与车辆，邓尼特多重比较试验的方差分析

通过VEP剖析M1对手

结论

406080120

0

10

20

30

N1潜伏期(毫秒)N1PAmplitude(?V)VEP(天)车辆(C)PIPEmg/kgPIPEmg/kg车辆(C)PIPEmg/kg车辆(C)PIPEmg/kg控制4060801.0....N1潜伏期(ms)振幅比VEP(天)pipemg/kgpipemg/kgpipemg/kgpipemg/kg控制车辆(合并)-20406080-N1潜伏期偏移(ms)N1-P2振幅降低(?V)车辆rPIPE=。p。p=。r=。VEP

VEP是髓鞘再形成的敏感指标，因为它能够在EAE小鼠出现临床残疾之前检测到视觉通路的损伤。

M1拮抗剂表现出强有力的髓鞘再形成和轴突保护作用，如N1潜伏期偏移减少和VEP振幅波形对称性保持所见。

通过这种体内发现范式筛选的多种化合物已经证明了髓鞘再形成，从而证实了小分子选择性M1拮抗剂是治疗多发性硬化的一种有前途的方法。

已经确定了一个临床开发候选人，并启动了独立研究

0

5

10

15

20

nlatencyshift(ms)vehiclepipe***p=0.8，***p0.1vsvehicleviaANOVA与Tukey天数MOG后诱导0N1-PAmplitude减少(?V)VehiclePIPE#*p=0.0，#p=0.vsvehicleviaANOVA与Tukey天数MOG后诱导

控制

车辆管路管路管路控制

0.0

0.5

1.0

1.5

。振幅比

30毫克/千克

p=0.6，#p=0.，p=0.通过与邓尼特的方差分析与车辆进行比较

VEP21天

??##

?

天真控制管道-

3毫克/千克

车辆管道

30毫克/千克

正确

左边的

脊髓和视神经的电镜照片显示髓鞘再形成

图2AN1潜伏期变化的差异可以在术后7天检测到，并且随着时间的推移变得更加显著，提示功能性髓鞘再形成。2B。N1P2振幅降低是由于视网膜神经节细胞的轴突损伤(Yo，y.等人，年)，PIPE可防止N1P2振幅随时间推移而降低。2C.在每只眼睛的散点图中的第21天，N1潜伏期偏移和N1P2振幅降低是显著相关的测量值。管道(Y=1.*X+19.88)比车辆(Y=0.*X+29.71)具有更大的正斜率。

车辆管路管路管路控制

40

60

80

N1延迟(毫秒)

30毫克/千克

???

????

??####

p=0.3，p0.1，p=0.，####p0.1span=""

通过与邓尼特车辆管道的方差分析对比车辆管道控制

0

10

20

30

N1-P2振幅(?V)

30毫克/千克

p=0.，p=0.与带有邓尼特的车辆方差分析

??

?

A

BD

英国广播公司

图3A。脊髓的电镜和迁移计算显示PIPE显示明显的髓鞘再形成。3B。PIPE显示%的髓鞘再形成和%的无髓鞘轴突显示接近幼稚小鼠的数值。3C。视神经的电镜和迁移计算表明，PIPE显示明显的髓鞘再形成。3D。PIPE-处理的小鼠比载体处理的小鼠有更高百分比的髓鞘再形成轴突。

甲乙

图5A。M1拮抗剂都显示出在诱导MOG后21天与载体处理的EAE小鼠有显著的N1潜伏期差异。不是所有的M1拮抗剂，但PIPE在3和30毫克/千克的剂量下，在第21天显示出与载体相比N1P2振幅的显著差异。N1潜伏期对N1P2振幅线性回归(xy散点图数据点未显示)，在每个M1拮抗剂的21天，期望的曲线是低N1潜伏期和高N1P2振幅。N1潜伏期与振幅比线性回归(xy散点图数据点未显示)21天时，期望的曲线为正斜率，脱髓鞘呈负斜率(Y=0.*X+1.)。M1拮抗剂PIPE在3毫克/千克(Y=0.*X0.)和30毫克/千克(Y=0.*X1.)两种浓度下均达到非常接近对照小鼠的正斜率(Y=0.*X0.)。

图4AD。每个治疗组的样本VEP波形示例显示3条VEP迹线和平均迹线。顶部面板是右眼，底部面板是左眼。4E。标准VEP波形分量。振幅比的描述和计算。4F。M1拮抗剂没有显示N1P2振幅值的退化，因此保持了P1N1和N1P2振幅波形的对称性

CD

学士学位

F

参考

1.格林AJ，，，克里巴，C，博斯卡丁，梅F，J，阿诺斯，德弗鲁姆，阿博纳斯阿，诺布塔H，朱A，弗里森M，杰罗娜R，冯班丁根HC，亨利RG，豪泽SL，陈JR.富马酸氯马斯汀作为多发性硬化症的再髓鞘治疗(ReBUILD):一项随机、对照、双盲、交叉试验。柳叶刀。年12月2日；(1):。

2.你好，克立斯托纳，蒂耶，格拉汉姆。视觉诱发电位潜伏期延迟是对大鼠视神经炎模型脱髓鞘的真实测量。投资眼科视觉科学。年；52(9):。

3.尤伊，克立斯托纳，蒂耶，古普塔·VK，格拉汉姆·SL。大鼠视神经炎模型中的轴突缺失与视觉诱发电位振幅密切相关

使用基于脑电图的标度。投资眼科视觉科学。年；53:。0.4...轴突直径(?m)(grationativepipevehicle)再髓鞘化轴突无髓鞘化轴突

P0.1PIPE和幼稚与车辆，方差分析，图基氏

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