期刊：InternationalJournalofBiologicalSciences
影响因子：4.发表时间：01年第一作者：ShengChen（陈胜）通讯作者：BaoguoXiao(肖保国教授,bgxiaoshmu.edu.cn)通信作者单位：DepartmentofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity（医院神经内科）；DepartmentofNeurologyandResearchCenterofNeurology,SecondAffiliatedHospital,KeyLaboratoryofMedicalNeurobiologyofZhejiang；Province,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine（浙江大医院神经内科和神经病研究中心，浙江省医学神经生物学重点实验室）；DepartmentofNeurology,FujianMedicalUniversityUnionHospital（医院神经内科）；DepartmentofNeurologyandInstituteofNeurology,FirstAffiliatedHospital,FujianMedicalUniversity（福建医院神经内科和神经内科研究所）；KeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,Lianyungang,China（连云港中药制药过程新技术国家重点实验室）Eomesodermin（Eomes）是一种转录因子，通过直接结合Rorc和Il17a基因的启动子区抑制Th17细胞的分化和增殖，同时c-Jun直接结合其启动子区抑制Eomes的表达。银杏二萜内酯K（GK）是从银杏叶中分离得到的二萜内酯。以往的研究表明，GK能降低磷酸化JNK（c-junn末端激酶）的水平。本文报道了银杏二萜内酯K（GK）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的疗效。
用野生型和CD4-Eomes条件敲除小鼠诱导EAE。腹腔注射GK。通过临床评估、单核细胞流式细胞术和组织病理学评估疾病严重程度、炎症和组织损伤。采用双荧光素酶报告子法测定Eomes体外转录活性。用JNK1激酶酶系统测定GK（IC50）的效价。
1.GK改善EAE的病情进展（注：图1。银杏二萜内酯K（GK）治疗可改善EAE的病情进展。（A）用MOG35-55免疫野生型C57BL/6小鼠，于第3天至第6天腹腔注射GK15mg/kg，每日1次。（B）GK治疗组（n=10）和溶媒对照组（n=0）EAE临床评分。（C）GK治疗组和溶媒对照组的最大EAE评分、末次EAE评分和平均起病天数。（D）GK治疗组和溶媒对照组Hamp;E染色。采用三种不同切片评估组织学炎症指数。（E）GK治疗组和溶媒对照组采用Luxol固蓝+伊红染色。数据代表至少三个独立的实验。显示平均值±标准差。*p0.05，**p0.01，**p0.，**p0.0。首先对野生型小鼠进行EAE诱导。如图1A所示，GK治疗从第3天开始，到第6天结束。结果表明，与对照小鼠相比，GK治疗显著降低了从第13天开始到结束的EAE评分（图1B）。另外，两组的最大EAE评分、最后EAE评分和平均发病天数也有显著差异(图1C)。组织病理学观察清楚地显示，GK治疗野生型EAE小鼠患脊髓炎症(图1D)和脱髓鞘(图1E)减少。（注：图。GK治疗可降低EAE的炎症水平。（A）于第9天、第18天和第8天腹腔注射通过FACS对细胞内细胞因子IL-17A和IFN-γ进行染色（B）第8天qRT-PCR检测脾脏MNCsRorc、IL17a、T-bet和Eomes基因的表达。（C）GK治疗组和溶媒对照组血清中IFN-γ、IL-17A和IL-6的产生。数据代表至少三个独立的实验。显示平均值±标准差。NS不显著，*p0.05，**p0.01，***p0.。
细胞内细胞因子染色显示，在第9天、第18天和第8天，脾脏和淋巴结CD4+T细胞中，Th17细胞显著减少，而不是Th1细胞（图A）。此外，qRT-PCR结果表明，GK处理后，Th17细胞的主要转录因子Rorc的表达以及Il17a的表达降低（图B）。有趣的是，在GK治疗后，Eomes的表达比T-bet显著增加了倍以上（图B）。同时，ELISA检测显示GK治疗的EAE小鼠血清中IL-17A和IL-6的产生显著减少。这些结果共同表明，GK治疗可通过抑制Th17细胞的发育和显著改变Eomes基因的表达来减轻EAE的严重程度。.GK可直接与JNK结合，抑制其激酶活性
（注：图3。GK结合模拟及剂量反应曲线。（A）GK的分子结构。（B）JNK的三维结构，以及预测对接位点。（C）GK体外剂量-反应曲线。）
使用systemsDock，用JNK进行了GK对接模拟。有趣的是，硅模拟表明GK（分子结构如图3A所示）可能直接与JNK结合（图3B）。为了验证这种模拟，进一步进行了JNK1激酶测定，以确定GK的抑制效力。如图3C所示，GK在体外可直接抑制JNK1激酶活性，其IC50测定为nM。
3.GK通过抑制磷酸化JNK增加Eomes的表达（注：图4。GK通过抑制磷酸化JNK增加Eomes的表达。（A）EAE第9天、第18天和第8天通过FACS检测GK治疗组（n=6）和溶媒对照组（n=6）的脾脏和淋巴结CD4+Eomes+T细胞。（B）EAE第9天和第18天脾CD4+T细胞中的磷酸化JNK（C）在有或没有GK处理的EAE第18天C-Jun和磷酸化C-Jun的western印迹。（D）K治疗前后EAE脾脏MNCs-Jun表达的变化。（E）不同长度hEOMES启动子荧光素酶质粒的构建及其在HEK93T细胞中的转录活性。（F）pFlag-c-Jun质粒共转染hEOMES启动子荧光素酶质粒在HEK93T细胞中的转录活性。数据代表至少三个独立的实验。显示平均值±标准差。NS不显著，*p0.05，**p0.01，**p0.，**p0.0。）
据报道，Eomes的表达在EAE的晚期可能会升高。其内部研究确实复制了这一发现（图4A）。为了进一步验证GK处理导致Eomes表达增加的假设，测试了EAE不同阶段（第9天p.i.，第18天p.i.，和第8天p.i.）Eomes的表达。尽管Eomes的总表达与第8天相比相对较低，但在第9天接受GK治疗后，CD4+T细胞中的Eomes表达显著升高（图4A）
此外，在CD4+T细胞中检测到磷酸化JNK水平（图4B）。与第9天相比，EAE第18天CD4+T细胞中磷酸化JNK水平升高，而GK治疗显著抑制其升高（图4B）。此外，发现在GK治疗组中，磷酸化c-Jun和总c-Jun的水平明显低于EAE组（图4C）。同时，Jun的mRNA表达也呈现出相同的趋势（图4D）。
由于Eomes在人CD4+T细胞上也有表达，为了知道GK处理是否会影响人Eomes的启动子区。构建了含有不同长度hEOMES启动子的荧光素酶报告基因质粒（图4E）。不出所料，如图4E所示，含有不同长度hEOMES启动子的启动子组的转录活性不同。GK处理（50μg/ml）4小时后，启动子组、3和4的转录活性略有增加，但显著增加（图4E）。证明，磷酸化JNK的主要下游之一c-Jun可以直接结合到Eomes的启动子区并抑制Eomes基因转录。为了复制这一结果，构建pFLAG-c-Jun质粒并将其与上述荧光素酶报告基因质粒一起转染HEK93T细胞。hEOMES启动子的相对活性显著降低了近50%（图4F）。这些结果共同证明GK通过抑制磷酸化JNK的水平间接增加Eomes的表达。
4.CD4+T细胞中Eomes的条件消融限制了GK在EAE中的作用（注：图5。基因切除CD4+T细胞中Eomes可阻断GK治疗对EAE的影响。用MOG35-55免疫CD4-EomescKO小鼠，于第3天至第6天腹腔注射GK15mg/kg，每日1次（A）GK治疗组（n=8）和溶媒对照组（n=1）的EAE临床评分。（B）GK治疗组和溶媒对照组的最大EAE评分、末次EAE评分和平均起病天数。（C）GK治疗组和溶媒对照组Hamp;E染色。（D）GK治疗组和溶媒对照组采用Luxol固蓝+伊红染色。数据代表至少三个独立的实验。显示平均值±标准差。NS不显著，*p0.05，**p0.01，***p0.。）本试验已经证实GK通过抑制磷酸化JNK的水平提高了Eomes在EAE中的表达，为了知道GK在EAE发生发展中的作用是否需要提高Eomes水平。在CD4-Eomes条件敲除小鼠（CD4-EomescKO）中进行EAE诱导。发现GK治疗的CD4-EomescKO小鼠的EAE临床严重程度并未降低（图5A）。最大EAE评分、最后EAE评分和平均发病天数与对照组治疗的CD4-EomescKO小鼠相同（图5B）。组织病理学评估显示，两组均出现严重炎症（图5C）和脊髓脱髓鞘（图5D），与临床评估一致。此外，细胞内细胞因子染色显示脾脏和淋巴结中CD4+T细胞中Th1和Th17细胞的数量没有差异（图6A）。此外，还发现CD4-EomescKO小鼠的CD8+T细胞中也有大量Eomes缺失。然而，在GK治疗后，其在CD8+T细胞中的比例仍然增加（补充图1）。QRT-PCR结果表明，GK治疗后Rorc的表达几乎相同，而Il17a的表达似乎有所下降，但无显著性差异（图6B）。尽管在CD4+T细胞中已被删除，但脾细胞中Eomes的总表达仍然增加（图6B）。毫不奇怪，GK治疗后T-bet的表达略有增加，考虑到它可能补偿Eomes的损失。经GK治疗的CD4-EomescKO-EAE小鼠血清IL-6分泌仍明显低于未经GK治疗的小鼠。然而，IFN-γ和IL-17A仍然没有改变（图6C）。磷酸化JNK在CD4+T细胞以及c-Jun和磷酸化c-Jun中保持不变（图7A-c）。毕竟，在CD4-EomescKO-EAE小鼠中的这些结果证明了CD4+Eomes+T细胞在GK治疗中的重要性和必要性。
（注：图6。GK治疗不能降低CD4-EomescKO-EAE的炎症水平。（A）第9天、第18天和第8天通过流式细胞仪对细胞内细胞因子IL-17A和IFN-γ进行染色。（B）通过qRT-PCR检测脾脏MNC中Rorc、IL-17A、T-bet和Eomes的基因表达。（C）GK治疗组和溶媒对照组血清IFN-γ、IL-17A和IL-6的产生。数据代表了三个独立的实验。显示平均值±标准差。NS不显著，*p0.05，**p0.01，***p0.。）
多发性硬化症被认为是年轻人神经功能障碍的最常见原因之一。Th17细胞失衡被广泛认为与MS的发病机制以及EAE模型密切相关。EAE模型已被证明有助于测试新的概念或治疗方法。本试验发现一种低分子量的化合物，银杏二萜内酯K，可以通过调节Th17细胞的发育来改善EAE的疾病进展。进一步证明GK治疗后Eomes的表达增加，而CD4+T细胞中Eomes的表达对GK治疗的效果至关重要。研究表明，Eomes的表达限制了外周Foxp3的诱导，尤其是在老年小鼠中。甚至最近，进一步证明Eomes控制Th17衍生（非经典）Th1的发育并抑制Th17细胞中的Rorc和Il17a。因此，Eomes在自身免疫中的作用更多地取决于它表达的细胞类型和我们给予的干预。在本研究中，发现随着Eomes表达的增加，GK治疗显著改善了EAE疾病的进展。
有人提出，Eomes通过促进IFN-γ和GMCSF的分泌来驱动EAE中致病性Th1细胞的发育，这是中枢神经系统炎症发展所必需的。此外，还发现野生型EAE晚期Eomes表达可能升高。因此，Eomes可能通过增强IFN-γ的产生而促进Th17细胞向Th1细胞表型的转变，并诱导晚期炎症。与此相反，本试验发现GK诱导的Eomes不能促进WT和CD4-EomescKO小鼠致病性Th1细胞的发育和IFN-γ的产生。其推测这可能是由于GK作为一种强大的血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂的抗炎能力。据报道，在EAE中阻断PAFR可减轻疾病进展，降低CNS炎症浸润，尤其是EAE早期产生IFN-γ。此外，据报道，PAF受体阻断可使IL-6显著降低43%。IL-6是Th17细胞分化的关键因子。Eomes诱导以及IL-6和IFN-γ阻断抑制了Th17和Th1细胞的分化，从而抑制了EAE的发展。然而，Eomes+CD4+T细胞和Eomeshigh-CD4+T细胞在EAE发生发展中的作用仍有待阐明。
如何理解GK不能缓解CD4-EomescKO小鼠EAE疾病的进展？据报道，通过TGF-β-JNK-c-Jun途径抑制Eomes可以促进Th17的完全诱导。此外，GK可能会中断磷酸化IRE1α和Traf之间的相互作用，并限制NRMCs中JNK的激活。在本研究中，发现GK还降低了淋巴细胞中磷酸化JNK和c-Jun的水平，从而增加了Eomes的表达。这种效应不仅存在于CD4+T细胞，而且还存在于CD4+T细胞和GK治疗EAE的整个过程中。另一方面，CD4+T细胞中Eomes的表达对GK的作用至关重要，因为CD4+T细胞中Eomes的条件性消融几乎完全阻断了GK在EAE模型中的作用。这提示，减少磷酸化JNK和增加Eomes水平可能是EAE模型中GK治疗的主要靶向途径（图8）。推测这是因为野生型EAE小鼠Th17的诱导遵循传统的TGF-β-IL-6通路和SMAD非依赖的TGF-β-JNK-c-Jun通路。GK治疗以IL-6为靶点，阻断了传统的TGF-β-IL-6通路。同时，Eomes诱导阻断SMAD非依赖性TGF-β-JNK-c-Jun通路。因此，野生型EAE小鼠Th17的发育明显减弱。然而，GK治疗在Eomes基因敲除的EAE小鼠中阻断IL-6，但未能阻断TGF-β-JNK-c-Jun通路。在这种情况下，Th17炎症可以完全诱导。
（注：图8。GK处理前后EAEs分子过程的差异。）
目前尚不清楚它是否对多发性硬化症患者的GK治疗有用，但在多发性硬化症的发生与Eomes水平降低之间确实存在一些临床证据，与健康对照组相比，多发性硬化患者的死亡率显著且持续降低。此外，许多全基因组关联研究（GWAS）以及我们之前的研究已经确认EOMES基因多态性是风险位点。有趣的是，所报道的风险位点均位于EOMES的非编码区，这可能与EOMES的表达调控有关。
综上所述，研究结果表明，GK对EAE的疾病进展具有强大的治疗作用。这种治疗效果是基于CD4+T细胞Eomes的升高和磷酸化JNK的抑制，揭示了CD4+T细胞Eomes对GK治疗效果的影响。此发现可能为Eomes在自身免疫中的作用提供了新的认识，并为MS的治疗提供了新的潜在途径。InternationalJournalofBiologicalSciences
01年第17期
陈胜肖保国教授，医院神经内科国家自然科学基金、浙江大学杰出学者研究基金会（、、、18893810101／））上海市卫生和计划生育委员会中医药研究项目（JP）参考文献
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