伴随着凛冽的寒风，小编又感冒了，喉咙肿痛，高烧不退，扁桃体肿的好象个鸡蛋，吃嘛嘛不香，扁桃体发炎了。打针挂水不能断，医生说：“哎哎哎~药不能停呀”。炎症真是让人又爱又恨的小妖精，可以保护人体不受侵害，但是也会引起人体过敏反应，比如类风湿性关节炎和红班狼疮症等免疫系统过敏病症疾病。拖着“病弱”的身躯，小编我对炎症是被什么调控的产生了莫大的兴趣。下边就让小编在本期的经典文献回顾中，跟随作者的脚步探究一下影响炎症的其中一个重要因子吧~
药不能停[]
Th7
说道免疫细胞，大家首先想到的一定是免疫T细胞，那么咱们一定要说道一下Th7，作为一种能够分泌白介素7(interleukin7,IL-7)的T细胞亚群，Th7在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义[]。
Th7是宿主防御细胞外病原体所必需的细胞，当调节失调时，可促进人类炎症疾病，包括多发性硬化、类风湿关节炎、炎症性肠病、银屑病和哮喘[3-]。白细胞介素3(IL-3)是Thelper7(Th7)细胞致病性所需的促炎细胞因子，但其调控这一过程的分子机制尚不清楚。研究者发现转录因子Blimp-(Prdm)是IL-3诱导的驱动Th7细胞炎症功能的关键因子，与RORγt协同作用，激活Th7炎症程序。今天咱们就一步一步来探讨一下，那么Blimp-(Prdm)是如何调节Th7的致炎性的吧。
Prdm的表达
既然咱们认为Prdm可以调节Th7细胞的致炎性，那么咱们肯定要了解一下Prdm在Th7细胞中是怎样诱导表达的啦。
很多数据显示，IL-3是Th7细胞获得效应功能的关键。为了研究IL-3R信号缺失和存在时的基因表达差异，我们将带有Il3r-/-同源标记的和野生型(WT)OT-IIT细胞转入C7BL/6小鼠体内，并进行分析（图A）。结果显示，WT和Il3r-/-中产生IL-7的细胞转录Il7a和Rorc的mRNA均高表达，而IL-3R缺陷型中产生IL-7的细胞转录Il3r的mRNA表达减少（图A）。与IL-7-细胞相比，WTIL-7+OT-II细胞中转录Prdm（Blimp-）、Csf和Tbx的mRNA表达量更高，并且在没有IL-3信号传导的情况下该表达显着降低（图A）。Th7信号基因如Il7a、Il3r、Rorc的表达在Th7细胞(RORγt+IL-7+IFNγ-)中升高，而真正的Th基因Ifng、Tbx在Th细胞(RORγt-IFNγ+IL-7-)中转录增强(图B)。与Th细胞相比，Th7细胞以及同时表达IL-7和IFN-γ(RORγt+IL-7+IFN-γ+)的炎性Th7细胞中，Prdm的转录水平显著升高(4-8倍)(图B)。并且Blimp-表达仅局限于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中的Th7细胞中，而不在Th细胞(图C)。此外，Blimp-+Th7细胞下调IL-，说明Th7群体更加成熟。这些结果显示IL-3信号可以促进Prdm的表达，进而促进Th7细胞的功能成熟。
Figure.IL-3SignalingInducesPrdmExpressioninTh7Cells
(A)Differentialgene-expressionanalysisofintracellularlystainedIL-7+andIL-7_wild-typeorIl3r–/–CD4.+CD4+OT-IIcellsfromdraininglymphnodesofCD4.+miceatday7postimmunizationwithOVA(33–)inCFA.
(B)Differentialgene-expressionanalysisofintracellularlystainedIL-7+andIFN-γ+cellsfromdraininglymphnodesofC7BL/6Jmiceatday7postimmunizationwithMOG3–inCFA.
(C)IntracellularstainingforIL-7,IFN-γ,andIL-expressionbyCD4+Blimp--YFP+cellsfromdraininglymphnodesofMOG3–immunizedBlimp--YFPreportermice(n=pergroup).Dataarerepresentativeofthreeindependentexperiments.ErrorbarsinallgraphsareSEMns,notsignificant;*p0.0,**p0.0,and***p0.00(Student’sttest).
(D)STATbindingsitesonPrdmlocusasassessedbychromatinimmunoprecipitation(ChIP)andmassiveparallelsequencingofTh7cellsdifferentiatedinthepresenceofTGF-β,IL-6,andIL-3.
(E)NaiveCD4+TcellsfromSTAT-3CKO(Stat3fl/flCd4cre),STAT-KO(Stat_/_),orwild-typecontrolmicewereculturedunderTh7condition(plateboundanti-CD3,anti-CD8,IL-b,IL-6,IL-3,anti-TGF-b,anti-TGF-b,anti-IFN-g,andanti-IL-4)for3days.PrdmandIl3rmRNAexpressionwereassessedbyquantitativeRT-PCR.SeealsoFigureS。
SupplementaryFigure
哦，原来IL-3是prdm在Th7细胞的一个关键因素啊，但是prdm在Th7细胞中难道只被IL-3诱导？就没有其他的隐藏BOSS了吗？
当然还有啦，在IL-3驱动的Th7细胞中，全基因组的STAT-3占用研究(ChIP-Seq)证实了STAT-3与Prdm位点在启动子、内含子和3端直接结合(图D)。为了进一步探讨IL-3介导的STAT-3或STAT-激活信号是不是Th7细胞中Prdm的表达的必要因素。我们将STAT-3cKO(Stat3fl/flCd4cre)和STAT-KO(STAT-/-)CD4+T细胞极化至Th7细胞，并测试Prdm的表达(图E)。结果表明STAT-3在Th7分化中十分重要，IL-3通过STAT-3对Prdm进行诱导。作为对照，我们还研究了同样依赖于STAT-3的Il3r和Il7a的诱导情况，最近的研究发现的IL-3靶基因Tbx是依赖STAT-表达，而不是STAT-3[6.7]。这些结果表明IL-3通过STAT-3可以直接诱导Blimp-在Th7细胞中表达。
Th7细胞缺失Blimp-说了这么多表达Blimp-的情况，那么要是Th7细胞中缺乏Blimp-，Th7细胞还能不能健康快乐的成长呢？
为了检测Blimp-缺失是否影响Th7分化，我们检测了CFA免疫小鼠的dLNs中活化的T细胞产生细胞因子的情况。在没有Prdm的情况下，YFP+CD4T细胞产生IL-7的比例略有降低(图A）。但更重要的是，缺乏prdm的IL-7细胞不能共同表达GM-CSF和IFN-γ(图B），些因子已被证明是Th7细胞炎症功能的关键因子[6.8-0]。在没有Blimp-的情况下，Th7细胞无法达到完全的功能成熟。另一个与Th7细胞成熟相关的因素是IL-的下调[]。我们发现约60%的Th7细胞是IL-7和IL-共同产生的(图C）。在没有Blimp-的情况下，Th7细胞均在早期活化阶段被抑制，无法下调IL-的表达。这些结果表明Blimp-在Th7细胞的全效应分化中起着关键作用。
果然，没有Blimp-的Th7细胞再也不能快乐的长大了。
Figure.Blimp-DeficiencyBlocksDevelopmentofInflammatoryTh7CellsCo-expressingIL-7,GM-CSF,andIFN-γ
(A)FrequencyandabsolutenumberofIL-7-producingCD4+YFP+Tcellsfromd7draininglymphnodesofMOG3–immunizedBlimp-CKO(Prdmfl/flRosa-YFPflDlckcre)andheterozygous(Prdmfl/WTrosa-YFPflDlckcre)mice(n=pergroup).
(B)FrequencyandabsolutenumberofGM-CSFandIFN-γ-producingIL-7+cellsfrom(A).
(C)Blimp-repressesIL-expressionbyTh7cells.ErrorbarsinallgraphsareSEMns,notsignificant;*p0.0,**p0.0and***p0.00(Student’sttest).
Blimp-cKO小鼠EAE的发生率降低听说Blimp-条件性敲除的小鼠，不容易得EAE呢，所以某些时候缺乏Blimp-难道也是有好处的？
为了研究Blimp-基因与EAE的关系，作者又选用了一种Th7细胞依赖性的人多发性硬化症的Blimp-cKO小鼠模型，来研究EAE的发生率和严重程度。Blimp-cKO小鼠的EAE降低(图3A，表)。在Blimp-cKO小鼠中枢神经系统(CNS)(脊髓和大脑)中的CD4+T细胞明显少于杂合型和野生型小鼠(图3B)。CD4T细胞的绝对数量减少(减少90%)进一步证实该能力缺陷的Blimp-cKOCD4+T细胞影响中枢神经系统(图3B)。此外，少数能够影响中枢神经系统的Blimp-cKOYFP+CD4+T细胞功能缺陷，IL-7产量降低(图3C)。更重要的是，blimp-缺失的Th7细胞共表达GM-CSF和IFN-γ的能力存在显著缺陷(图3D)。已知IFN-γ生成的RORγt+Th7细胞存在于EAE的病变组织中，在多发性硬化患者的中枢神经系统中优先积累[]，证实其对炎症的促进作用。
Figure3.Blimp-DeficiencyReducesEAEIncidenceandSeverity
(A)ClinicalscoresofBlimp-CKOmiceafterEAEinduction.(n=9pergroup).
(B)FrequencyandabsolutenumberofCD4+TcellsintheCNSofPrdmconditionalknockoutmiceat6dayspostimmunization(n=0forhet,n=forko).
(C)FrequencyandabsolutenumberofIL-7-producingYFP+CD4+TcellsfromtheCNSofmicein(B).
(D)FrequencyandabsolutenumberofGM-CSFandIFN-g-producingIL-7+YFP+CD4+Tcellsfrom(B).Dataarerepresentativeofthreeindependentexperiments.ErrorbarsinallgraphsareSEMns;**p0.0(Student’sttest).
Blimp-介导Th7致炎性的分子机制Blimp-对Th7致炎性影响这么大，咱们必须研究一下是啥分子机制啦。
为鉴定Blimp-在Th7细胞中的转录靶点，对纯化的IL-7进行全基因组Blimp-占用率研究(ChIP-Seq)。EGFP+细胞在TGF-β、IL-6、IL-3存在下分化(图4)。本研究发现Blimp-直接与Il3r、Il7和Csf调控区域结合(图4）此外，Blimp-在p、STAT-3和RORγt附近共定位(图4)。推测Blimp-调控IL-3介导的Th7效应子功能主要是通过诱导Il3r表达来扩大IL-3信号，同时增强Il7和Csf的转录。为了验证这一点，我们在活化的Th7细胞中异位表达Blimp-，并在Th7细胞中表达Blimp-强烈上调Il3r表达(图A)。为了进一步证实blimp-介导的Il3r调控，用Blimp-对IL-3R荧光探针标记的小鼠进行转导。Blimp-过表达显著增强IL-3R荧光探针在Th7细胞中的表达(图B)。与既往研究一致，Blimp-过表达并未改变IL-7的表达，说明Blimp-不能直接抑制IL-7[3]。异位表达blimp但是不表达rorγt,强烈诱导Th7细胞产生GM-CSF(图C)。综上所述，这些结果验证了Blimp-是IL-3调控Th7的主要影响因子。最近的一篇论文表明，Blimp-和IRF4可以促进Treg细胞中IL-0的产生[4].然而，过表达Blimp-并没有促进Th7细胞产生IL-0(图E)。
Figure4.Blimp-DirectlyBindsTh7SignatureGenes
Blimp-,STAT-3,co-activatorp,andRORγtbindingonIl3r,Csf,andIl7flociasassessedbychromatinimmunoprecipitationandmassiveparallelsequencingofpurifiedIL-7.EGFP+cellsdifferentiatedinthepresenceofTGF-β,IL-6,andIL-3.TheRORγtdataisextractedfromCiofanietal.(0)[4](GEO#GSMWTRorgChIP;GSM4RORγKORORγChIP).
Blimp-异位表达仅在RORγt+Th7细胞中驱动Th7标记基因，而在Th0细胞（CD4+Th细胞）中不驱动Th7标记基因，说明RORγt的存在对Th7细胞中Blimp-调节的功能至关重要(图D)。为了进一步证实这一点，利用RORγ特异性敲除的RORγcKO（Rorcfl/flRosacre/ERT)）小鼠进行研究。IL-3激活的Th7细胞中GM-CSF的稳健表达(图Dtoppanel)。在活化阶段，Rorc的缺失不仅降低了IL-7的表达，并且完全抑制了Th7细胞对GM-CSF的表达(图Dtoppanel)。即使在没有添加IL-3的情况下，Blimp-过表达也足以诱导Th7细胞产生最佳GM-CSF(图Dbottompanel)。最重要的是，Blimp-中Rorc的缺失导致Th7细胞完全阻断GM-CSF的表达，抑制Th7的致病分化。这些数据表明Blimp和RORγt协同作用稳定Th7炎性分化程序。
FigureEctopicBlimp-ExpressionUpregulatesTh7SignatureGenes
(A)NaiveOT-IIcellswereactivatedunderTh0orTh7conditions,retrovirallytransducedondaywithpMIG(Empty)orpMIG-Blimp-RV,rested,andreactivatedfor7hrfollowedbygene-expressionanalysisofsortedGFP+cells.
(B)IL-3R-mCherrycellswereactivatedunderTh7conditions,retrovirallytransducedondaywithpMIG(Empty)orpMIG-Blimp-RV,rested,andreactivatedfor7hrfollowedbysurfaceanalysisofIL-3R-mCherryonbulklivecells(top)ortransducedGFP+CD4+cells(bottom).
(C)NaiveOT-IIcellswereactivatedunderTh7conditions,retrovirallytransducedondaywithpMIG(Empty),pMIG-RORγtorpMIG-Blimp-RV,rested,andreactivatedfor7hrfollowedbyGM-CSFanalysisbyELISAoftransducedculturesupernatants.
(D)Differentialgene-expressionanalysisofretrovirallytransducedandsortedGFP+Th0orTh7cellsat7hrpost-secondarystimulation.Heatmaprepresentsfolddifferences
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